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自2020年10月上海快靈發布“非洲豬(zhu)瘟高敏(min)PCR試劑(ji)盒(he)”（下(xia)稱高敏(min)試劑(ji)盒(he)）以(yi)(yi)(yi)來，其(qi)出(chu)色的(de)(de)(de)靈敏(min)度、敏(min)感性(xing)、特異性(xing)及穩定性(xing)迅(xun)速被廣大豬(zhu)場實驗(yan)室認可。隨著熒光PCR相關技術(shu)的(de)(de)(de)普及以(yi)(yi)(yi)及用戶群體的(de)(de)(de)增大，部(bu)分之前未被重(zhong)視的(de)(de)(de)問題也(ye)逐漸顯(xian)露(lu)出(chu)來。本篇(pian)我們探(tan)討(tao)下(xia)各廠家都諱莫如(ru)深的(de)(de)(de)一個點——“假陽”問題，以(yi)(yi)(yi)及相應的(de)(de)(de)解(jie)決方案。

“假陽(yang)”問題，事實上在(zai)熒光PCR領域并不(bu)少見(jian)，而(er)造成假陽(yang)產生(sheng)的原因也(ye)是紛(fen)繁復雜：如操作(zuo)不(bu)當污(wu)染、環境氣(qi)溶膠污(wu)染或者(zhe)試(shi)劑(ji)(ji)生(sheng)產過程污(wu)染等。本文(wen)所(suo)要(yao)探討(tao)的“假陽(yang)”，主要(yao)指(zhi)因試(shi)劑(ji)(ji)特異(yi)性導致的假陽(yang)，換句(ju)話說，即文(wen)中所(suo)提(ti)(ti)的“假陽(yang)”，與(yu)操作(zuo)者(zhe)、儀(yi)器、環境均無關(guan)(guan)，只(zhi)與(yu)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)內的試(shi)劑(ji)(ji)有關(guan)(guan)。那么(me)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)中到底(di)什么(me)與(yu)“假陽(yang)”相(xiang)關(guan)(guan)呢(ni)？縱觀商業化的非(fei)瘟病毒PCR檢測試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)，其中都會提(ti)(ti)及一(yi)個重要(yao)參數(shu)——特異(yi)性。

何(he)為(wei)特異性(xing)呢？在(zai)PCR擴(kuo)增(zeng)過程中(zhong)，如果(guo)我們要擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)(de)非洲豬瘟DNA片(pian)(pian)段(duan)在(zai)整條DNA鏈上不止出現了一次，或者樣品中(zhong)混有的(de)(de)(de)其他物(wu)種、細胞或病(bing)毒的(de)(de)(de)DNA中(zhong)含有類似的(de)(de)(de)DNA片(pian)(pian)段(duan)，則(ze)可(ke)能會將其他片(pian)(pian)段(duan)擴(kuo)增(zeng)出來(lai)(lai)，那最(zui)后儀器(qi)顯示出來(lai)(lai)的(de)(de)(de)陽(yang)性(xing)結果(guo)就不一定是非瘟病(bing)毒DNA造成的(de)(de)(de)，于是陽(yang)性(xing)結果(guo)也就變成了假(jia)(jia)陽(yang)。因此(ci)，通俗來(lai)(lai)說，特異性(xing)反應的(de)(de)(de)是試劑盒能擴(kuo)增(zeng)出特定DNA片(pian)(pian)段(duan)的(de)(de)(de)性(xing)能，特異性(xing)越低，則(ze)試劑盒擴(kuo)增(zeng)其他片(pian)(pian)段(duan)的(de)(de)(de)概率(lv)就越大，即“假(jia)(jia)陽(yang)”幾率(lv)更大。
   市售的(de)眾多非瘟病(bing)毒PCR檢(jian)測試(shi)劑盒中，絕(jue)大多數廠商(shang)在宣(xuan)傳其試(shi)劑盒特異(yi)(yi)性(xing)時均(jun)會標注＞99%，最低也(ye)不會低于98%，快靈的(de)高敏(min)試(shi)劑盒也(ye)是如(ru)此，特異(yi)(yi)性(xing)可達到99.9%，屬(shu)實是已(yi)經做(zuo)到了(le)極限(xian)，即(ji)使(shi)PCR技術發展至今(jin)，因為模板DNA的(de)不確定，依(yi)然(ran)無(wu)法保證100%的(de)特異(yi)(yi)性(xing)。也(ye)正因此，特異(yi)(yi)性(xing)，也(ye)就是假陽的(de)問題是被(bei)大家(jia)忽視了(le)。

在(zai)服務客(ke)(ke)戶(hu)的過(guo)程中，我們(men)發現很多客(ke)(ke)戶(hu)在(zai)進(jin)行非瘟病毒檢測(ce)遇(yu)到極弱樣本(ben)或疑似樣本(ben)時，對于陽性場，往(wang)往(wang)遵(zun)循的是“寧殺(sha)錯，不放過”，而對于(yu)陰(yin)性場，往往帶來(lai)(lai)心(xin)理的(de)(de)(de)恐慌，需要確(que)(que)認到底(di)是不是陽性。的(de)(de)(de)確(que)(que)，隨著非瘟一(yi)波(bo)波(bo)的(de)(de)(de)襲(xi)來(lai)(lai)，各檢(jian)測單(dan)位的(de)(de)(de)工作量都(dou)史無(wu)前例的(de)(de)(de)倍增(zeng)，再重新來(lai)(lai)一(yi)遍的(de)(de)(de)全面復核，顯然是對人(ren)力和成本(ben)的(de)(de)(de)巨大(da)考驗。面對這樣(yang)的(de)(de)(de)大(da)環(huan)境，快靈(ling)人(ren)陷入了(le)沉思。

“我們為什么要(yao)寧殺(sha)錯？”

“當真沒有辦(ban)法消除假陽么？”

帶著這樣(yang)的問題(ti)，我(wo)(wo)們開始了新的一(yi)(yi)輪又一(yi)(yi)輪的嘗試：提升(sheng)試劑(ji)盒的靈敏(min)度、將(jiang)特異性(xing)由(you)99%提升(sheng)至99.9%……或許，我(wo)(wo)們可(ke)以把眼界放寬，不局限于單純的擴增？

于(yu)是，高(gao)(gao)敏(min)試劑盒(he)上市半年(nian)后，我們在高(gao)(gao)敏(min)試劑盒(he)基(ji)礎之上研發出其(qi)“升(sheng)級版(ban)”——快(kuai)靈高(gao)(gao)敏(min)試劑盒(he)（熔解確認版(ban)）。

快(kuai)靈高敏(min)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)(he)(he)（熔(rong)(rong)解(jie)確(que)認(ren)版），其性能(neng)參數與高敏(min)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)(he)(he)一致，我(wo)們(men)(men)同(tong)樣(yang)保證(zheng)其靈敏(min)度、敏(min)感(gan)性、穩(wen)定(ding)性、特異性處在行業頂尖(jian)水平，確(que)保客戶可(ke)以第(di)一時間(jian)檢(jian)測出陽性樣(yang)本。包(bao)括其操(cao)作、擴增階段也(ye)與高敏(min)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)(he)(he)別無二(er)致，至此，我(wo)們(men)(men)可(ke)以把快(kuai)靈高敏(min)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)(he)(he)（熔(rong)(rong)解(jie)確(que)認(ren)版）等同(tong)于高敏(min)試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)(he)(he)。詳見(jian)表1：

表1：高敏試(shi)劑(ji)盒與假陽(yang)確(que)認試(shi)劑(ji)盒基本性能參數對比(bi)

但，重點來了！快(kuai)靈是怎(zen)么做到的(de)(de)(de)？快(kuai)靈高敏(min)試劑(ji)盒（熔(rong)解(jie)確認版）突破性地(di)使用了一個(ge)新的(de)(de)(de)反應(ying)程序——熔(rong)解(jie)曲(qu)線。熔(rong)解(jie)曲(qu)線能鑒(jian)別不(bu)同的(de)(de)(de)DNA片(pian)段(duan)，依靠的(de)(de)(de)不(bu)是Ct.值，而是其特有(you)的(de)(de)(de)熔(rong)解(jie)峰，即(ji)Tm值，即(ji)使一個(ge)DNA片(pian)段(duan)中僅相差一個(ge)堿基，都能導致Tm值變動。依靠Tm值的(de)(de)(de)判定就可以確認之前擴增陽(yang)性的(de)(de)(de)非(fei)瘟樣本是否為真的(de)(de)(de)非(fei)瘟陽(yang)性，以此達到鑒(jian)別假(jia)陽(yang)，消除客戶疑(yi)慮(lv)的(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)。

圖1：擴(kuo)增曲(qu)線Ct.值(zhi)判(pan)讀陰(yin)陽        圖2：熔解曲(qu)線檢測疑似/弱陽樣(yang)本，排除假(jia)陽

非(fei)瘟新(xin)形勢(shi)下，除了(le)要(yao)求試劑盒(he)更(geng)早的(de)檢測出陽(yang)性，更(geng)需(xu)要(yao)真(zhen)正(zheng)“精準”檢測。快靈(ling)高(gao)敏試劑盒(he)（熔(rong)解(jie)確認(ren)版(ban)）除了(le)超(chao)高(gao)的(de)靈(ling)敏度(du)、特異性，更(geng)是“自帶(dai)”熔(rong)解(jie)曲線，讓假(jia)陽(yang)無(wu)處可(ke)藏(zang)，讓弱(ruo)陽(yang)“站得(de)住腳(jiao)”，真(zhen)正(zheng)做到打消客戶(hu)疑慮(lv)，真(zhen)正(zheng)做到“不殺錯、不放(fang)過(guo)”。